ความสำคัญของเมืองสุพรรณบุรีในฐานะเป็นเส้นทางการเดินทัพและการสงครามเด่นชัดเมื่อสมเด็จพระนเรศวรทรงประกาศให้กรุงศรีอยุธยาเป็นอิสระไม่ขึ้นแก่กรุงหงสาวดี ทำให้พระเจ้ากรุงหงสาวดีทรงพิโรธและส่งกองทัพเข้ามารบพุ่งกับกรุงศรีอยุธยาหลายครั้ง ซึ่งต้องใช้เส้นทางการเดินทัพผ่านเมืองสุพรรณบุรีเกือบทั้งสิ้น ดังนั้นเมื่อครั้งพระเจ้ากรุงหงสาวดี ตรัสให้พระเจ้าเชียงใหม่และพระยาพะสิม ยกทัพมาตีกรุงศรีอยุธยาครั้งแรก หลังการประกาศอิสรภาพจากกรุงหงสาวดี พระยาพะสิมก็ได้ใช้เส้นทางผ่านด่านเจดีย์สามองค์ ผ่านกาญจนบุรีเข้าสู่เมืองสุพรรณบุรี ในขณะที่กรุงศรีอยุธยาก็ได้ใช้เมืองสุพรรณบุรีเป็นสนามรบ เพื่อป้องกันกรุงศรีอยุธยาครั้งนั้น ดังความในพระราชพงศาวดารว่า ...พระบาทสมเด็จพระพุทธเจ้าอยู่หัวทั้งสองพระองค์ ตรัสรู้ข่าวข้าศึกอันยกมาทั้งสองทางสามทางนั้น... ตรัสให้พระยาคลังเป็นยกกระบัตร ให้ยกทัพเรือนั้นไปเมืองสุพรรณบุรี ครั้นทัพเรือไปเถิงเมืองสุพรรณบุรีให้รบพุ่งกันด้วยทัพพระยาพะสิม ซึ่งตั้งอยู่ในสุพรรณบุรีนั้น...และทัพพระยาสิมนั้นจะตั้งอยู่มิได้ ก็เลิกทัพกลับออกไป... ในแผ่นดินสมเด็จพระนเรศวรมหาราช การศึกระหว่างกรุงศรีอยุธยาและกรุงหงสาวดีที่สำคัญคือ สงครามยุทธหัตถีระหว่างสมเด็จพระนเรศวรมหาราช และสมเด็จพระมหาอุปราช แห่งกรุงหงสาวดี ซึ่งเชื่อกันว่าสนามแห่งมหาสงครามครั้งยิ่งใหญ่นี้เกิดขึ้นในเขตแดนของเมืองสุพรรณบุรีและยังปรากฏร่องรอย ของซากเจดีย์ซึ่งเชื่อว่าเห็นเจดีย์ยุทธหัตถีที่สมเด็จ พระนเรศวรมหาราชทรงโปรดเกล้าให้สร้างขึ้นเป็นเครื่องหมายแห่งชัยชนะ ดังความในพระราชพงศาวดารว่า ...ฝ่ายพระมหาอุปราชเสด็จยกทัพหลวงถึงกาญจนบุรีเห็นเมืองร้างเปล่าไม่มีคนก็เข้าพระทัยว่าชาวพระนครรู้การแล้ว... จนเสด็จถึงตำบลตระพังตรุ แดนเมืองสุพรรณบุรี ให้ตั้งทัพชัยโดยขบวนแล้ว... ส่วนสมเด็จพระนเรศวรเป็นเจ้ากับสมเด็จพระอนุชาธิราช เจ้าตรัสปรึกษาด้วยมุขอำมาตย์ทั้งปวง ว่าข้าศึกของมหาอุปราชยกมาครั้งนี้เราจะกรีพลออกต่อ ยุทธนาการกลางแปลงดีหรือจะตั้งรับในพระนครดี... สมเด็จพระพุทธเจ้าอยู่หัวทั้งสองพระองค์ ได้ฟังมุขมนตรีกราบทูลดังนั้นก็ชอบพระทัยนัก แย้มพระโอษฐ์ดำรัสว่า ซึ่งปรึกษา การสงครามครั้งนี้ต้องความดำริเรา... ให้พระยาราชพฤทธานนท์ เป็นยกกระบัตร ยกไปขัดรับหน้าข้าศึกอยู่ ณ ตำบลทุ่งหนองสาหร่าย... สมเด็จพระเจ้าอยู่หัวทรงช้างพญาไชยานุภาพ... สมเด็จพระอนุชาธิราชเจ้าทรงช้างต้น พญาปราบไตรจักร... แล้วเสด็จไปตามท้องทุ่งเพลาเที่ยงพระอาทิตย์ทรงกลดร่มช้างพระที่นั่งไปจนบ่าย 3 โมง พอกระทั่งกองหน้าซึ่งตั้งอยู่ตำบล หนองสาหร่าย เสด็จประทับเกยใต้ฉายาไม้ประดู่ใหญ่อันสถิตย์เหนือจอมปลวก เอาเป็นนิมิตครุฑนามชัยภูมิ สั่งให้เร่งตั้งค่ายกองหน้าหลัง ปีกซ้ายขวาเป็นกระบวนปทุมพยุหะ... ครั้งอรุณรุ่งแสงสุริโยภาส พระบาทสมเด็จบรมบพิตรพระพุทธเจ้าอยู่หัวทั้งสองพระองค์ เสด็จยังเกยตรัสให้ท้าวพระยาในกองทัพหลวงยกออกไปตั้งกระบวนเบญจเสนา.. . สมเด็จพระนเรศวร เป็นเจ้าจึงตรัสร้องเรียกด้วยพระสุรเสียงอันดังว่า พระเจ้าพี่เราจะยืนอยู่ใยในร่มไม้เล่าเชิญออกมาทำยุทธหัตถีด้วยกันให้เป็นเกียรติยศ ไว้ในแผ่นดินเถิด...พระมหาอุปราชาได้ฟังดังนั้น ละอายพระทัยมีขัตติยราชมานะก็บ่าย พระคชาธารออกมารับ.. พระนเรศวรเป็นเจ้าเบี่ยงพระมาลารับ พระแสงของ้าวมิได้ต้องพระองค์ เจ้าพญาไชยานุภาพสะบัดลง ได้ล่างแบกถนัด พลายพัทกอเพลียกเบนไป สมเด็จพระนเรศวรเป็นเจ้าได้ทีจ้วงฟันด้วยพระแสงพลพ่ายต้องพระอังสาเบื้องขวา พระมหาอุปราช ตลอดลงมาจนถึง ปัจฉิมมุราประเทศซบลง กับคอช้าง.. สมเด็จพระพุทธเจ้าอยู่หัวตรัสให้ก่อพระเจดีย์ฐานสวมศพพระมหาอุปราชไว ้ตำบลตระพังตรุ... ต่อมาในสมัยกรุงรัตนโกสินทร์ พระบาทสมเด็จ พระมงกุฏเกล้าเจ้าอยู่หัว รัชกาลที่ ๖ โปรดให้ค้นหาพระเจดีย์ยุทธหัตถี เจ้าหน้าที่ ฝ่ายต่าง ๆ ได้ช่วยกัน ค้นพบกองมูลดินปกคลุมด้วยต้นไม้ จึงได้ดำเนินการพิสูจน์หาหลักฐานประกอบแน่ชัดว่าเป็นเจดีย์ยุทธหัตถี ที่สมเด็จ พระนเรศวรมหาราชโปรดให้ สร้างขึ้นเป็นอนุสรณ์ในครั้งทรงทำยุทธหัตถีกับพระมหาอุปราชา พระบาทสมเด็จพระมงกุฎเกล้าเจ้าอยู่หัว ทรงโสมนัสที่ได้ค้นพบพระเจดีย์ยุทธหัตถีนี้ จึงได้เสด็จ พระราชดำเนินไปทรงประกอบพระราชพิธีบวงสรวงถวายราชสักการะ เมื่อวันอังคารที่ ๒๗ มกราคม พ.ศ. ๒๔๕๖ มีประกาศสังเวยเทวดาโดยสมเด็จพระเจ้าบรมวงศ์เธอ กรมพระยาดำรงราชานุภาพ ทรงนิพนธ์และทรงอ่าน ในวันสังเวยครั้นถึงรัชสมัยพระบาทสมเด็จ พระปรมินทรมหาภูมิพลอดุลยเดช รัชกาลที่ ๙ พร้อมด้วยสมเด็จพระนางเจ้าฯ พระบรมราชินีนาถได้เสด็จ พระราชดำเนินไปบวงสรวงสมเด็จพระนเรศวรมหาราช ณ อนุสรณ์ดอนเจดีย์ จังหวัดสุพรรณบุรีเมื่อวันที่ ๒๗ กันยายน พ.ศ. ๒๔๙๘ ซึ่งขณะนั้นเจดีย์ยุทธหัตถียังเป็นมูลดินปกคลุมด้วยต้นไม้ ในปีต่อมารัฐบาลได้ตระหนักถึงพระราชวีรกรรมและคุณูประการอันยิ่งใหญ่ที่สมเด็จพระนเรศวรมหาราช ทรงมีต่อประเทศชาติไทยอันควร จะได้เทิดทูน พระเกียรติยศให้ปรากฎเป็น พระบรมราชานุสาวรีย์และประกาศให้ถือวันที่ ๒๕ มกราคมของทุกปี เป็นวันสำคัญ วันหนึ่งของชาติไทยและกองทัพไทย จึงได้ตั้งคณะกรรมการดำเนินการก่อสร้าง พระบรมราชานุสาวรีย์สมเด็จพระนเรศวร มหาราชโดยครอบองค์สถูปมูลดินนั้นไว้ เมื่อการก่อสร้าง สำเร็จแล้วคณะรัฐมนตรีโดยมีจอมพล ป. พิบูลย์สงคราม เป็นนายกรัฐมนตรี ได้กราบบังคมทูลพระกรุณาขอ พระราชทานเป็นงานรัฐพิธี เสด็จพระราชดำเนินไปทรง เปิดพระบรมราชานุสาวรีย์สมเด็จพระนเรศวรมหาราช ในวันที่ ๒๕ มกราคม พ.ศ. ๒๕๐๒